Кротамин содержится в яде гремучей змеи Crotalus durissus terrificus и обладает обезболивающими, антибактериальными и гемолитическими свойствами. Другие препараты, такие как эналаприл и эптифибатид, основаны на змеином яде и одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
Преимущество выбранного дикого типа заключается в том, что они обладают способностью проникать в клетки, даже в форме D-энантиомера, наблюдаются высокая стабильность и специфичность, а также избирательность в отношении целевой протеазы 3CL », – заключила исследовательская группа.
Выделение пептида и введение его в низкой дозе может помочь в разработке лечения коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) для людей с тяжелыми заболеваниями.
Изучение
Исследователи экспрессировали слитый белок SARS-CoV-2 3CLpro_GST, необходимый для репликации вируса, на клетках E.coli Lemo21, а затем очистили их. На вирусную протеазу воздействовали как кротамином, так и модифицированными пептидами с замещенными остатками цистеина, известными как L-CDP2-9, для определения лучшего пептида-ингибитора.
Первые тесты на ингибирование показали, что пептиды L-CDP1, L-CDP2, L-CDP7 и L-CDP8 обладают 80% ингибированием вирусной протеазы. Они также проверили минимальную концентрацию, необходимую для кротамина, чтобы иметь 100% ингибирование против 3CL про протеазы. 100% ингибирование протеазы было достигнуто при 300 мкМ.
L-CDP1 вызывал полное ингибирование активности протеазы SARS-CoV-2 при 30 мкМ. Производное кротамина с аминокислотной заменой, известное как L-пептид-7, вызывало 100% ингибирование при 60 мкМ.
Замена остатков цистеина, в частности замена в положении 36, увеличивала ингибирующую активность L-CDP7.
Анализ протеазы на основе флуоресценции подтвердил конформационную форму пептида во время ингибирования. Было обнаружено, что пептиды L-CDP1, L-CDP7 и L-CDP8 являются конкурентными ингибиторами.
Результаты показывают, что эти пептиды напрямую взаимодействуют с аминокислотными остатками, расположенными в активном сайте, или с аминокислотами, расположенными в области связывания субстрата протеазы, предотвращая проникновение субстрата в активный сайт », – пояснили исследователи.
Чтобы защитить от деградации пептидов L-энантиомера, исследовательская группа создала CDP1 и CDP7 в форме D-энантиомера. Причина заключалась в том, что пептиды D более стабильны; Пептиды L-CDP могут разрушаться при гидролизе протеазами. Поскольку D-пептиды были зеркальным отображением L-пептидов, команда предсказала, что аффинность связывания и их ингибирующий эффект должны быть аналогичными. Результаты показали, что D-CDP1 и D-CDP7 также являются конкурентными ингибиторами. Однако взаимодействие D-CDP1 с протеазой SARS-CoV-2 в десять раз сильнее, чем D-CDP7.
Основываясь на результатах, команда затем изучила эффективность молекулярного стыковки L-CDP1 и D-CDP1 с помощью веб-моделирования. Моделирование показало, что аминокислотные остатки вирусной протеазы взаимодействуют со связыванием лиганда, что указывает на потенциальный способ взаимодействия.
Аминокислотный остаток His41, по-видимому, взаимодействует с водородной связью остатков Lys31 L-CDP1. Остальные аминокислотные остатки находятся в области связывания субстрата, подтверждая, что взаимодействие является конкурентным ингибированием.
D-CDP1, с другой стороны, работает, помещая пептид в субстрат-связывающую область, вызывая блокировку активного сайта протеазы.