Кератиноциты волосяного фолликула предлагают простой и доступный путь для создания индивидуально индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, ИПСК, с минимальными неудобствами для пациентов, показывает исследование, представленное сегодня на Конгрессе ESC 2011.
Исследование, представленное доктором. Катрин Стрекфусс-Бёмеке из Германии получила премию ESC для молодых исследователей в области фундаментальной науки.
“Данные, собранные в этом исследовании, демонстрируют простую и быструю возможность создания ИПСК из волосяных фолликулов пациентов с генетическими заболеваниями сердца и их дальнейшей дифференциации в функциональные кардиомиоциты. Эти клетки позволят нам моделировать сердечное заболевание у этих пациентов, исследовать механизмы заболевания, проводить скрининг лекарств и разрабатывать терапевтические стратегии для конкретных пациентов,” объяснил д-р Streckfuss-Boemeke.
Большинство ИПСК, описанных в предыдущих исследованиях, были получены из фибробластов кожи или клеток костного мозга, которые требуют хирургического вмешательства. Целью этого исследования было использование альтернативного источника клеток, который можно было бы легко и неинвазивно изолировать от пациентов и который показывает высокую скорость пролиферации для эффективного перепрограммирования.
Болезни сердца – одна из основных причин смерти в развитых странах. Хотя большинство жертв сердечной смерти – пожилые люди, многие дети и молодые люди в возрасте до 35 лет умирают каждый год из-за различных сердечных патологий. Недавний прогресс в области молекулярной биологии и генетики человека позволил выявить генетические причины многих сердечных заболеваний, включая множественные причины внезапной сердечной смерти (ВСС).
Генетически обусловленные сердечные заболевания можно разделить на две группы: заболевания со структурным изменением сердца, такие как гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) или аритмогенная дисплазия правого желудочка (АРВД), и вторую группу без структурных изменений, приводящих к опасной для жизни сердечной аритмии. Примерами являются первичные электрические болезни сердца (каналопатии), такие как синдром удлиненного интервала QT (LQTS), синдром короткого интервала QT (SQTS), синдром Бругада (BrS) и катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (CPVT), которая вызывает внезапную неожиданную сердечную смерть. у практически здоровых молодых людей.
Некоторые генетические сердечные заболевания не редки, например, HCM (хотя это наиболее частая причина SCD в детстве), LQTS и BrS. Однако некоторые заболевания встречаются редко, например, CPVT и ARVD, и очень часто связаны с высокой смертностью среди детей и молодых людей. Кумулятивная смертность от CPVT составляет 30-50% к возрасту 20-30 лет.
До сих пор большинство исследований пороков развития сердца или заболеваний взрослых людей проводилось на животных моделях, особенно на мышах. Однако мыши во многом отличаются от людей; например, сердце мыши бьется со скоростью 500 ударов в минуту, а сердце человека бьется со скоростью 70 ударов в минуту. Таким образом, использование плюрипотентных стволовых клеток является многообещающим подходом для изучения сердечных заболеваний.
Плюрипотентные стволовые клетки обладают двумя основными свойствами: они могут неограниченно пролиферировать и могут образовывать около 220 различных типов клеток, присутствующих во взрослом организме, включая функциональные кардиомиоциты. В последнее время очень популярным стало перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (так называемые ИПСК). Для индукции плюрипотентности белки (e.грамм. факторы плюрипотентности Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 Klf4 и cMyc) вводятся в клетки. Таким образом, клетки ИПСК человека предлагают особенно привлекательную возможность преобразовать соматические клетки пациентов с сердечными заболеваниями в ИПСК и дифференцировать эти ИПСК в кардиомиоциты, специфичные для пациента. Таким образом, мы можем создать модель сердечных заболеваний человека для анализа молекулярных механизмов и разработки индивидуальных терапевтических стратегий. Это было бы невозможно при использовании биопсии сердца у живых пациентов из-за ограничений, касающихся процедуры и количества взятых тканей.
Однако большинство линий ИПСК, описанных в предыдущих исследованиях, были получены из фибробластов кожи или клеток костного мозга, которые требуют хирургического вмешательства на пациенте для их выделения. Поэтому нашей целью было использовать альтернативный источник клеток, который можно было бы легко и неинвазивно изолировать от пациентов и который демонстрирует высокую скорость пролиферации для эффективного перепрограммирования. Мы решили использовать кератиноциты, которые можно легко выделить из волос живых людей.
Предыдущие исследования показали, что кератиноциты, выщипанные из волос, трудно культивировать с низкой способностью к пролиферации. Поэтому нашей первой целью была оптимизация условий культивирования кератиноцитов из волосяных фолликулов человека. Мы выщипали около 40 волос у 41 человека в возрасте от 22 до 52 лет, изолировали и культивировали кератиноциты волосяных фолликулов с эффективностью 90%. Через 10-14 дней у нас было достаточное количество кератиноцитов в культуре, и мы начали индукцию репрограммирования этих волосковых клеток в плюрипотентные стволовые клетки. Мы ввели различные комбинации генов плюрипотентности (Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 (OSNL) или Oct, Sox2, Klf4 и cMyc (OSKM) с помощью лентивирусной системы). Oct4 и Sox2 – два фактора транскрипции, которые действуют как активатор транскрипции других генов, связанных с плюрипотентностью. Nanog больше участвует в поддержании плюрипотентности, а Lin28, например, использовался для повышения эффективности перепрограммирования. Через 2-3 недели мы увидели колонии ИПСК (Kera-ИПСК) в культуре с типичной компактной морфологией плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК).
Мы провели три серии экспериментов для доказательства плюрипотентности созданных kera-iPSC: сначала мы проанализировали экспрессию типичных маркеров плюрипотентности на уровне генов и белков. Мы наблюдали, что эндогенная экспрессия OCT4 и SOX2 очень низкая в кератиноцитах, в отличие от значительного увеличения ИПСК, происходящих из кератиноцитов. Мы не обнаружили эндогенной экспрессии NANOG и LIN28 в кератиноцитах, но высокую индукцию в ИПСК. Эти данные по экспрессии генов были подтверждены на уровне белка. Нам удалось показать, что kera-iPSC были положительны по маркерам, общим для плюрипотентных клеток, включая щелочную фосфатазу, Nanog, Oct4, Sox2, Tra-1-60 и SSEA4.
Вторым доказательством плюрипотентности генерируемых ИПСК является их способность к дифференцировке in vivo и, следовательно, способность образовывать тератомы. Чтобы проверить это, мы вводили клетки подкожно мышам SCID-beige с подавленным иммунитетом. Через 8 недель мы наблюдали образование тератом, в которых были обнаружены дифференцирующиеся клетки всех трех зародышевых листков, включая хрящ, эпителий с кишечной дифференцировкой и нервные ткани.
В последней серии экспериментов мы проанализировали потенциал дифференцировки ИПСК in vitro. Используя так называемое образование эмбриоидных телец (ЭТ), мы индуцировали клетки спонтанно дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков эмбриона in vitro.
В течение этого времени in vitro тканеспецифические гены экспрессировались контролируемым путем развития способом, включая AFP-положительные клетки печени, положительные по тирозингидроксилазе нейрональные клетки и тропонин-Т-положительные клетки сердца. Но самое захватывающее наблюдение во время этой дифференциации – ритмично бьющиеся кластеры в наростах БЭ.
Все эти эксперименты показывают, что ИПСК, полученные из кератиноцитов волос, действительно плюрипотентны и могут быть дифференцированы в бьющиеся кардиомиоциты.
Эти данные демонстрируют простую и быструю возможность создания ИПСК из волосяных фолликулов пациентов с генетическими заболеваниями сердца и их дальнейшей дифференциации в функциональные кардиомиоциты. По сравнению с кардиомиоцитами, полученными из волосяных фолликулов здоровых людей, мы сможем моделировать сердечное заболевание, исследовать механизмы заболевания, проводить скрининг лекарств и разрабатывать терапевтические стратегии для конкретных пациентов (рис.1). В заключение, кератиноциты волосяных фолликулов предлагают простой и доступный способ создания ИПСК для конкретных пациентов и с минимальными неудобствами для пациентов.